1.  新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80 ℃保存)，厚度为 5～6 μm。

2.  载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。抗体

3.  如不马上染色，可密封后- 20 ℃保存。

4.  染色前用冷丙酮在 4 ℃固定 10-20 分钟。

5.  PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

6.  3% H2 O2灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光；

7.  用 PBS 洗 2 次，每次 5 分钟；

8.  正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 （保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清 （与第二抗 体 同源动物血清）处理，37 ℃，15 分钟。

附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50 μ+5 μl (10%抛洒量) 计算。

9.  滴加*抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加*抗体，37 ℃ 2 小时（也可置于 4 ℃冰箱过夜） 。

10.  PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

11.  滴加生物素化的二抗，37 ℃，40 分钟。

12.  PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

13.  滴加三抗 （SAB 复合物） ，37 ℃，40 分钟。

14.  PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

15.  DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止） 。

附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg + PBS 10 ml，待*溶解后分装成 1 ml，100 μl，50 μl ，20 μ l 等，-20 ℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20 μl + PBS 1000 μl + 3% H2O2  5 μl

16.  自来水（细水）充分冲洗。

17.  苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

18.  自来水冲洗返蓝，15 分钟。

19.  梯度酒精脱水：80%，2 分钟  95%，2 分钟  100%，2 次，5 分钟。

20.  二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分钟抗体

21.  封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。