真核细胞的mRNA 在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽"的过程,因此mRNA的3′末端都带有一段Poly A,这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5′端的序列各不相同,如何获得全长的cDNA,如何扩增由微量的mRNA逆转录得到cDNA文库,如何利用已知片段序列得到全长的cDNA (即RACE) ,曾经是令人困扰的问题。常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头,利用已知的接头序列再进行扩增,或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3′末端加上一连串的G或者C (或者A /T) ,再通过补齐粘末端,利用已知的两头序列进行扩增。但是,这些方法在不同程度上存在一些问题,比如接头的连接效率非常有限,会导致部分信息的丢失,再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品,需要经过反复的纯化,会损失很多有用的信息,特别是少量样品中的低丰度信息,很大程度上会影响结果的准确性。另外,由于mRNA容易部分降解,很难确定得到的cDNA 是否就是全长的cDNA,还是cDNA的片段。

    SMART技术的出现是一个新的里程碑。SMART技术是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性,只要单管,一步即可完成,不需要额外的cDNA抽提纯化,或者额外的酶反应,只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA文库,更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度,可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、用已知序列钓全长cDNA (RACE) ,以及用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。细胞

1、SMART法的原理

    SMART技术的全称是Switching Mechanism At 5′end of the RNA Transcrip t,其名称反映了该技术的精髓,它充分利用了反转录酶Powerscrip t TM RT和限制性内切酶Sfi I的特性(流程如图1 ) 。该方法中全长cDNA的获得是借助Powerscrip t TM RT的末端转移酶活性来实现的。此外,实验设计时,在cDNA*、二链引物的5′端引入了sfiI(A)和Sfi I(B)位点,因此只需对目的cDNA进行单酶切( Sfi I酶切) ,即可实现对其定向克隆。

2、SMART技术流程

    与普通的建立cDNA文库方法相比, SMART技术的不同主要包括三个方面的内容:

(1)mRNA的制备:从总RNA 中纯化mRNA 的方法是Oligo ( dT) 2纤维素柱层析法。总RNA 通过柱时,mRNA3′端poly(A)与纤维素上连接的Oligo ( dT)链结合而吸附于柱上,从而被分离出来。

( 2) cDNA *链的合成:在合成cDNA 的反应中事先加入的3′末端带Oligo ( dG)的SMART引物,以Oligo ( dT) 12218为引物,mRNA模板在到达mRNA的5′末端时碰到真核mRNA*的“帽子结构",即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个( dC) , SMART引物的Oligo ( dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板,逆转录酶会自动转换模板,以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA 单链直到引物的末端。细胞

(3)通过长距离PCR (LD - PCR)扩增cDNA:以事先加入的3′末端带Oligo ( dG)的SMART引物为5′端引物,以*链3′末端Oligo ( dT) 12～18引物的互补序列为3′端引物,在DNA聚合酶的催化下,互补合成cDNA的第二链;合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5′帽子结构的mRNA 才能利用这个反应得到能扩增的cDNA,扩增得到的cDNA就是全长cDNA,且使全长cDNA得到大量的复制和扩增,因此可消除基因组DNA和无poly(A)的RNA,并且允许用很微量的总RNA或mRNA构建高比例全长cDNA。