(一)常用细胞转化实验 常用人工诱发细胞转化实验包括物理、化学和病毒诱导三种，下面介绍化学致癌物和病毒细胞转化两个实验。 l.化学致癌物诱导细胞转化实验 (1)原理：化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程。通过细胞表型的改变，反映各种理化因素的致癌性，同时，可模拟化学致癌物在体内致癌的过程，并可对发生转化的细胞做直接观察和各种分析。其中以叙利亚地鼠胚胎初代培养细胞较为常用，现在以N一甲基一N'一硝基一N一亚硝基胍(MNNG)进行细胞转化实验为例。 (2)材料 1)动物：鼠(如：叙利亚地鼠，金仓鼠等)。 2)细胞生长液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培养液。 3)维持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培养液。 4)消化液：O．25％胰蛋白酶(含O．01％EDTA)。 5)冻存液：含lO％小牛血清的DMSO。 6)致癌剂：MNNG。 7)洗液：PBS。 (3)方法 1)取材：妊娠第13天鼠，取数个同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用0．25％胰蛋白酶(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，滤过，低速离心，吸除消化液，加入营养液制备成细胞悬液，接种人75cm培养瓶中，接种密度为10～20×106／75 cm，37℃培养2～3d。 2)贮存：选大批生长状态良好的细胞冻存。 3)致癌物处理：取冻存细胞，解冻后接种于25ml培养瓶中，每瓶含细胞10万～30万。待细胞生长进入指数增生期时，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培养基，在37℃孵箱中培养12～48h。 4)低血清培养：弃掉MNNG致突变剂，用温PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，继续置温箱中培养2～3周，然后改用含5％血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞牛长，但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶。 5)转化灶的形成：用致癌物处理过的细胞于10d后在正常细胞之间，可产生数量不等的转化灶。转化灶由密集而重叠的细胞组成。在透光检查时，肉眼可见有大小不等的白色斑块转化灶。显微镜下观察，未转化的成纤维细胞转化后，胞体增大，成多边形，生长无方向性，失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠。在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别相当明显。上皮细胞转化后形态变化不如成纤维细胞差别大，需仔细识别。 6)转化细胞的分离：将培养瓶放在倒置显微镜下观察转化细胞，将转化灶用记号笔标记。用细胞刮去除未发生转化的外圈正常细胞。向瓶内加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化数分钟。镜下观察细胞变圆时，加人含10%小牛血清的*培养液，反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培养。成单层后，再用传代法扩大培养。 (4)转化细胞观察与鉴定：转化灶由密集而重叠的细胞组成。肉眼可见有大小不等的白色斑块转化灶。显微镜下观察，成纤维细胞转化后，胞体增大，成多边形，生长无方向性．失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠。在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别明显。上皮细胞转化后形态变化不如成纤维细胞差别大，需仔细识别。 2．病毒转化细胞实验 (1)原理：很多病毒都有转化细胞的作用，尤以致癌病毒zui为明显。EB病毒(EBV)是近年来常用于转化细胞的病毒。该病毒对人二倍体细胞的转化效果，常用于建立淋巴细胞永生细胞系。人外周血B淋巴细胞膜上有。EB病毒受体，当EB病毒与受体结合后，B淋巴细胞可发生转化，成为体外长期传代生长的细胞系。 (2)材料 1)病毒：EB病毒液(取自培养的B95—8细胞)。 2)转化细胞：柠檬酸或肝素抗凝人外周血。 3)细胞培养液：含20％胎牛血清的RPMI 1640。 4)抗生素：青霉素、链霉素和庆大霉素。 5)洗液：PBS。 (3)方法 1)血液制备：抗凝全血1～2ml，分装于15ml离心管中，每管O．5ml，置于4℃冰箱中放置30min后，加入不含血清的RPMI1640离心洗一次，用含20％胎牛血清的细胞培养液制成细胞悬液。 2)EB病毒的获得：培养的B95—8细胞，10000r／min离心15min去除细胞碎片，再经24000r／min，离心90min获得病毒沉淀，以1：100体积培养液溶解获得EB病毒浓缩液。 3)EB病毒转化：加入EB病毒液，O．3～0．5ml／管，37℃水浴30min～2h，并不时摇动，以利于病毒吸附和并防止血凝块产生。 4)分装入50ml培养瓶中，同时补加培养液，5ml／管，置入含5％CO2的37℃温箱中培养。 5)细胞培养一周后再补入2ml培养基。 6)每3～4d加液或半量换液，随细胞数量增多，可分装人大瓶中培养。为了提高转化效率，常将全血冻存复苏后采用。 (4)结果观察与鉴定：需每天镜检培养物，开始培养时，镜下可见大量红细胞，难以观察到单核细胞。培养5～7d后，单个或成团的淋巴细胞增殖迅速，成大团块，呈悬浮生长，红细胞已*消失，转化完成。 |
