病毒在细胞内增殖，首先要进到细胞内，在细胞内合成大量子代病毒，再释放到细胞外。此过程一般要经过吸附、穿人、脱壳、生物合成、装配与释放5个阶段，又称复制周期。经过病毒复制，宿主细胞发生变化。吸附是病毒与宿主细胞表面受体的结合阶段，是构成感染的*步。通过细胞培养观察病毒对细胞的致病变作用及用受体免疫血清阻断病毒与受体作用是研究病毒致病机制zui常用的方法。 一、材料 1．细胞24孔培养板MAl04细胞单层。 2．病毒轮状病毒，浓度为l00TCD。 3．细胞培养液RPMI 1640培养液。 4．TKS缓冲液 10mmol／L Tris—HCl，O．9％NaCl pH8．2。 5．Hank’s液。 二、方法 1．可溶性轮状病毒受体制备大量培养的MAl04细胞，用11强洗2次，按lO7个／甜细胞浓度溶于1％NP一40的TBS缓冲液中，置4℃1h并每15m|n摇动摇1次，4℃3500r／min离心5分钟，吸上清液于一70℃速冻，即为MAl04细胞可溶性受体。再经饱和硫酸铵沉淀及免疫亲和层析法纯化．即为纯化受体蛋白。 2．受体蛋白免疫血清制备取BALB／C小鼠多只，皮下多位点注射纯化受体蛋白，每位点4μg。于第2、3、5、6周每只鼠经尾静脉加强注射受体蛋白4μg，第7周眼内眦静脉取血分离血清，即为受体免疫血清。 3．细胞保护性试验将MAl04细胞培养于24孔板，待细胞成层后，用Hank’s液将细胞洗2次，加入RPMIl640液3倍稀释的受体免疫血清，每孔O．1ml，共4孔，同时设3种对照，即正常细胞、正常鼠血清及病毒对照，每对照4孔。于37℃作用1h后，各iL均用Hank’s液洗3次，并加入胰蛋白酶预处理的轮状病毒，每孔O．1ml，于37℃作用1h后，加维持液至1ml，37℃5％CO2孵箱培养24～一48h逐日观察CPE。 三、结果分析 分析接种病毒24～48h后MAl04细胞cPE情况。如果正常鼠血清对照CPE为+++～++++；免疫血清实验组CPE为一或±；单纯病毒对照孔为+++～++++时，即说明受体免疫血清起到保护作用，可以阻断病毒与细胞受体的结合，而使病毒不感染宿主细胞。 |
