细胞凋亡时，染色体双链DNA裂解产生的核小体DNA可以与核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4结合形成复合物，保护其DNA不被核酸酶降解。在细胞凋亡的早期，只有少数细胞的DNA发生断裂，用生化法很难通过凝胶电泳方法检测出DNA梯度。使用抗组蛋白和抗DNA的单克隆抗体ELISA法检测凋亡细胞，不仅可以提高了检测的灵敏度，还可以在早期检测细胞凋亡。 (一)材料 1．待检细胞HL一60细胞(髓性白血病细胞株，ATCC：CCL240)105／ml。 2．试剂 (1)包被液(临用前配制)：①O．1mol／L PBS(pH9．2)：Na2C03 1．36g、NaHCO 3 7.35g、双蒸水950ml．可用1mol／LHCl或1mol／LNaOH调pH至9．2，加双蒸水定容至1000ml。②抗组蛋白抗体：取适量抗体冻干粉，加lml双蒸水充分溶解，取1pl抗组蛋白抗体，加9μl 0．1mol／L碳酸盐缓冲液(pH9．2)。 (2)PBS(pH7．3)：①10×贮存液：NaCl 80g、KCI 2g、Na2HP04·7H20 11．5g、KH2PO4 2g，溶于1000ml双蒸水中。②l×工作液；以双蒸水lO倍稀释贮存液。 (3)裂解液：10mmol／L Tris—HCl(pH 8．O)、10mmol／L NaCl、10mmol／L EDTA、100mg／ml蛋白酶K、1％SDS。 (4)封闭缓冲液：0．05％Tween一20、1 mmol／L EDTA、0．25%BSA或5％脱脂奶粉、0.05％叠氮钠(NaN3)。 (5)洗涤缓冲液(含0．05％NaN3的PBS)：取NaN3 0．5g，溶于1000ml PBS缓冲液中。 (6)酶联抗体工作液(临用前配制)：取适量辣根过氧化物酶(horseradish peroxides，HRP)标记的抗DNA冻干粉，溶于1ml双蒸水中，取lμl HRP一抗DNA抗体与9μl封闭缓冲液混匀。 (7)底物缓冲液(DAB—H2O2)：取50～75mg DAB，溶于100ml 0．05 mol／L Tris～HCl(DH7．4)中，室温下在暗处振荡溶解，用滤纸过滤后，4℃暗处保存，临用前加0．01％～0．003％H2O2。 (8)喜树碱溶液(1μg／ml、2μg／ml、4μg／ml)：称量400μg喜树碱(camptotheein)，溶于培养液(4μg／m1)中。再用培养液分别稀释2倍(2μg／ml)和4倍(1μg／ml)。 3．器具酶标微孔板(96孔或48 孔)、酶标分析仪、平台振荡仪、低温离心机。 (二)方法 1．抗组蛋白抗体包被酶标板，每孔加人包被缓冲液lOOμl，室温下包被1小时，或4℃包被过夜。甩去包被液，每孔加入细胞裂解缓冲液200μ1，置于室温下30min。甩去裂解缓冲液，每孔加入封闭缓冲液200μl．室温下封闭30min。 2．甩去封闭缓冲液，每孔加洗涤缓冲液250μl，静置30s，甩干。如此反复洗板3次。 3．取指数生长期的HL一60细胞，用培养液稀释至105／ml。各取500μl(5×104个)细胞，加入4个Eppendorf管内。 4．于3个管中分别加入含有凋亡诱导剂喜树碱1μg／ml、2μg／ml和4μg／ml的培养液500μl，另一管仅加培养液500μl作为阴性对照，置37℃、5%CO2孵箱中孵育4h。 5．置台式离心机上，1500r／min(或2000g)离心5min，去上清液，加入lml培养液再悬浮细胞，同法再离心一次，将细胞再悬浮于lml细胞裂解液中，4℃作用30min。 6．置台式低温超速离心机上，1500r／min离心10min。小心吸出400μl上清液于小试管中，与3．6ml细胞裂解液混合(1：10稀释，lml中相当有104个细胞)，立即用于核小体的酶标测定，或于一20℃冻存，待样品集中到一定数目时再测定。 7．在包被抗组蛋白抗体的酶标板上，于每孔加待测样品(不同量凋亡诱导剂作用管及对照管)溶液100μl，每样品平行作2孔，另设2孔只加细胞裂解缓冲液，作为测定本底的空白对照，室温下孵育90min。 8．甩去反应液，如上述步骤2法洗板后，每孔加HPR一抗DNA抗体100μl(空白对照孔不加)，室温下孵育90min。 9．甩去酶标抗体，如上述步骤2法洗板后，每孔加DAB—H2O2底物缓冲液lOOμl，置室温下暗处反应lO~20min。以底物缓冲液为对照，在酶标检测仪上于波长405nm处测定各孔OD值。如果样品孔OD值超过了仪器测量范围，则将样品适当稀释后再测定。 (三)结果 待检测样品OD值等于从3个待检测样品平行7L的OD值减去本底OD值。它代表正在死亡和已经死亡的细胞数目。凋亡细胞以富集系数(enrichment factor，EF)表示，EF值的高低代表稀释到胞质中的核小体单体或寡聚物的多少，等于待测样品OD值除以阴性对照孔的OD值。 在一般条件下，加人底物反应15min后，本底OD值应小于样品OD值的1／lO。严格控制培养细胞中的死细胞数目很重要。通常在指数生长期的培养细胞中有3％～8％的死细胞，这些死细胞会使OD值增加。 |
