在构建重组表达体系时，当目的基因和载体重组并导人宿主后，并非能全部按照预先设计的方式重组和表达，由于各种副反应的存在、重组DNA导人宿主的低效率、操作的失误及其他不可预测因素的干扰，真正获得目的基因并能有效表达的重组子只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不舍目的基因的克隆。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正所需的重组子，需要采用一系列筛选和鉴定的方法。 1.耐药性基因筛选法 筛选重组菌的具体方法因所采用的载体一宿主系统的不同而不同。很多细菌表达系统的载体一般带有抗生素抗性筛选标记，如四环素抗性基因(tetr)、氨苄西林抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)等。当编码有这些耐药性基因的质粒携带目的DNA进入宿主细胞后，便可使重组细胞在含这些抗生素的培养基中生长。由于要筛选的是含目的DNA的重组菌，为了区分含重组质粒的克隆和含空质粒的克隆，可以采用插人失活检测法。这种方法是将目的DNA插入到载体的某个抗性基因之中．使该抗性基因失活，这样含重组质粒的克隆便不能在含这一抗生素的培养基中存活，而含空质粒的克隆则能存活。例如前面介绍的pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因，抗氨苄西林基因(ampr)上有单一的Pst I位点，抗四环素基因(tetr)上有SalI和BamHI位点。当外源DNA片段插入到SalI／Bam H I位点时，使抗四环素基因失活，这时含有重组体的菌株从amprtetr变为amp r tet s。这样，凡是在含氨苄西林的平板上能生长，而在同时含氨苄西林和四环素的平板上不能生长的菌落就可能是所要的重组体。 利用耐药性基因进行筛选的另一方法是直接筛选法。由于在一种质粒上往往具有两种耐药性基因，用插入失活检测法时要在分别含两种抗生素的平板上进行筛选。为了做到在一个平板上直接筛选，可将插入缺失重组后转化的宿主细胞培养在含四环素和环丝氨酸的培养基中，重组体驯。生长受到抑制，非重组体tet s虽能使细胞生长，但因环丝氨酸可在蛋白质合成时掺人而导致细胞死亡。重组体tet s因仅仅是受抑制，故接种到另一培养基中时便可重新生长。 2. a-互补法 这是目前经常使用的重组子筛选方法。许多载体都带有一个大肠杆菌争半乳糖苷酶基因(lacz)的调控序列和前146个氨基酸等蛋白质N端部分序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)。它并不破坏β-半乳糖苷酶N端的功能。在一些大肠杆菌宿主菌中，染色体上含有编码口一半乳糖苷酶C端部分序列的基因，可以表达出口一半乳糖苷酶的C端蛋白质。当宿主和质粒上的lacZ基因片段单独存在时，分别表达出的蛋白质产物不具有 β-半乳糖苷酶活性。但它们同时存在时，这些蛋白质司表现出酶活性，买现J宿王细胞和质粒上分别携带的lacZ基冈片段的功能互补，称为a一互补。由a一互补而产生的大肠杆菌细胞在诱导剂IPTG的作用下，β-半乳糖苷酶催化X—gal变为蓝色，从而产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，破坏了质粒上的lacZ基因片段，不能表达出正确的N端蛋白质，从而不能进行a一互补，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。因此，这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 3.营养缺陷型筛选法 还有一些表达体系采用的是营养缺陷型筛选标记，如一些酵母表达体系等。这样的体系中，宿主细胞为营养缺陷型，不能在基本培养基上生长，而载体含有该缺陷型所缺失的基因．因此重组子可以在基本培养基上生长。这样，采用基本培养基就可起到选择的效果。 通过上述方法筛选后，可以排除大量的未经重组的宿主细胞。但是，这还不能保证剩余的细胞中目的基因全部按照预先设计的方式重组和表达。因此，zui后还需要通过直接检测表达产物的方法加以鉴定。如果目的基因的编码产物是酶，可以通过测定酶活力定量地确定表达水平。如果基因的编码产物不具有已知的催化活性，则可采用蛋白质电泳、酶联免疫等方法定性、定量地测定表达产物。 |
