绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP等一系列荧光蛋白为研究细胞内蛋白质的定位提供了*的标记物。通过构建融合蛋白的方法使之能够标记过表达的目的蛋白，可以反映蛋白的亚细胞定位。在转染中，将两种甚至多种过表达融合蛋白的质粒转染到同一细胞中，就可以通过分析不同荧光蛋白的信号来了解不同蛋白在细胞中的共定位情况（SambrokandRusel 2001）。构建融合蛋白的过程中，可以将荧光蛋白融合到蛋白质的N端或者C端，因为荧光蛋白基团可能会封闭蛋白质的N端或者 C端对蛋白质定位的影响。在研究中，推荐大家使用Clontech公司的pEGFP（绿色荧光基团）和 dsRED（红色荧光基团）系列载体，它们分别提供了N端和C端两种不同的融合方式以及3个阅读框的选择。其中N载体将荧光蛋白融合在C端暴露蛋白N端，而C载体将荧光蛋白融合在N端暴露蛋白C端。在构建克隆的过程中，建议同时构建N端和C端两种融合方式的重组质粒来进行下一步的实验。

    有条件的话（如果手上有GFP等荧光基团的相应抗体）建议先使用用Western检测质粒融合表达的效果。以下实验以使用12孔板（因为每孔大小正好合适作为被检标本）作为培养容器为例。

（一）试剂材料

1.12mm圆形盖玻片 将盖玻片用酸液处理过夜，自来水漂洗20次，双蒸水漂洗20次，用镊子取出放在干燥的丝绸上晾干，干烤灭菌，这样可以防止玻片上出现痕迹，还可以防止玻片互相粘连。

2.PBS磷酸盐缓冲液 大家可以参考分子克隆配方配制，建议配制20×储存液，用前稀释。

3.4%多聚甲醛固定液 现用现配：将4g多聚甲醛 和80ml

PBS混合，再加适量氢氧化钠（调pH用）于60-80℃水浴溶解，冷却至室温后用氢氧化钠调pH至7.8，之后定容至10ml，经滤纸过滤后于4℃保存。4%多聚甲醛固定液一定要认真配制，否则细胞无法正常固定，形态就无法保持。

4.双蒸水

5.DAPI（二脒基-2-苯吲哚盐酸）溶液 用双蒸水将DAPI配置成2mg/ml储存液，于-20℃避光保存，使用时用甲醇以1∶20稀释成使用浓度1μg/ml。在我们的实验中发现储存时间较长的工作液会使染色背景脏，所以使用新近配制的工作液来进行染色。

6.甲醇

7.无水乙醇

8.封片剂 预先配制的2% DABCO（1，4-二氮二环［2.2.2］辛烷）/PBS制备90%的甘油。在60℃下，溶解2gDABCO（抗荧光淬灭剂）于90ml甘油中，15-30min。再加入10ml1mol/LTris-HCl，pH7.5，用 5mol/LHCl调节pH值到8.0，冷却到室温，再加 10ml20% thimerosal（溶解于水），4℃于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存。DABCO的作用是防荧光淬灭，虽然也有有很多其他的防淬灭剂可供选择，但是DABCO应用得。如果需要使用其他的防荧光淬灭剂，则应该参照相应的说明来使用。

9.指甲油 选购无色的指甲油来进行封片，因为有的彩色指甲油中掺入的荧光物质在镜下也能显示荧光。也有报道说用指甲油封片可以导致 GFP信号的丢失，因为指甲油中含有乙酸乙酯/丙酮成分。碰到这种情况可以使用融化了的固体石蜡来代替。

（二）样品处理步骤

1.将处理好的盖玻片放在12孔板底部。如果细胞贴壁不牢（例如 HEK293）或者细胞半贴壁（例如PC12），可以用细胞刮子将鼠尾胶原均匀地涂抹在玻片上。也可使用1mg/ml多聚赖氨酸，但是效果不如鼠尾胶原。

2.将与培养基混匀后的细胞悬液加入孔中。这一步的混匀非常重要（推荐采用前后、左右“十字”形式混匀，避免涡旋），如果不匀，一般细胞都会聚集在玻片中央区域，会对形态观察产生不利影响。分细胞的时候要注意：进行形态观察的时候应该将细胞分得相对稀一些，密集的细胞不利于形态观察。每孔细胞的数量根据细胞大小的不同应该作出相应调整，一般104细胞即可。

3.待大约24h后，细胞贴壁，即可进行转染。

这一步要根据转染试剂的转染参考条件进行，因为细胞分得较稀，所以对于转染试剂的毒性也会更加敏感，因而有时候有必要将转染试剂和质粒减量。初次试验建议转染空载体作为阳性对照来监测转染效率，分别设单转染和共转染孔来方便一种蛋白影响另一种蛋白表达时的结果分析）所以一共要设以下孔：①ProteinA-pEGFP-N1；②ProteinA-pEGFP-C1；③ProteinB-dsRED-N1；④ProteinB-dsRED-C1；⑤pEGFP；⑥dsRED。

然后根据实验的结果，来选取合适的质粒（融合之后没有影响蛋白的定位且表达良好）来进行共转染。

    当然，也可以和预实验组一起进行。因为对于大部分蛋白质，N端决定了它的定位，所以使用N1载体进行实验的情况要多一些。设这么多组合是为了确保实验结果能反映细胞内蛋白质的真实亚定位和相互作用共定位。

4.转染完成大于24h后即可在倒置荧光显微镜下观察转染表达效果，当出现明亮的荧光信号时就可以进行固定。（只有明亮的绿色GFP和红色dsRED才能被认为是阳性信号，浅谈的颜色一般只是本底。）

5.固定用PBS将细胞洗3遍，每遍5min。注意：如果细胞贴壁不牢（例如HEK293）或者是半贴壁细胞（例如 PC12），应该将12孔板倾斜，将PBS从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果细胞贴壁不牢，必须使用同样的轻柔方式），室温固定10-15min

6.用PBS将细胞洗3遍，每遍5min。方法同前。

7.用双蒸水将细胞洗1遍，每遍5min。方法同前。

8.DAPI染核如果需要染核，在细胞上滴加 DAPI工作液。如果细胞贴壁不牢（如HEK293）或者是半贴壁细胞（例如 PC12），应该将12孔板倾斜，将PBS从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。37℃湿盒中孵育15min。如果不需要染核，可直接进行乙醇漂洗。

9.甲醇漂洗

方法同前。

10.乙醇漂洗

方法同前。

11.用针头将在乙醇中的玻片撬起一侧，用镊子将玻片取出放在滤纸上晾干，有细胞的一面朝上。

12.封片。

    取8μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，封片剂会慢慢渗透分布于整个盖薄片。（封片剂不能多加，否则玻片会滑动，不利于在镜下观察。）

13.待封片剂均匀分布于盖玻片下，即可在周围用指甲油封住（指甲油也只能加适量）。如果直接观看而不需要保存较长时间，这一步可以省略。