DIGE荧光差异蛋白表达分析系统在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并*次引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。ELISA试剂盒 荧光染料种类虽多，但用于蛋白质组样品标记的荧光染料不同于普通荧光染料，标记后的蛋白质不应该有等电点上的改变，分子量上的改变也应该保持zui小而且不同荧光染料导致的分子量的改变应该一致。用于蛋白质预先标记的荧光染料分为两类，zui小标记和饱和标记。其中zui小标记荧光染料包括三种，分别是Cy2，Cy3和Cy5。这三种荧光染料化学结构上相似，分子量接近，带有相同的活化基团-NHS脂，可以特异性的标记在赖氨酸残基的ε氨基上，由于三种染料均带有一个正电荷，这样通过取代反应蛋白质的等电点不会发生改变，保证了不同样品中的相同蛋白质可以泳动到相同的位置。不过要注意，过多的染料标记会导致蛋白质的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白质的赖氨酸残基被荧光标记修饰，才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性，因此，在标记样品时，保证合适的蛋白质和染料的摩尔数比例至关重要。通过调整合适的pH值、合适的染料和蛋白质的摩尔比，可以保证每个蛋白质分子zui多只标记上一个染料分子，来保证蛋白质的分子量变化zui小。ELISA试剂盒 一、主要特点： 1. DIGE荧光差异分析，用于检测蛋白表达中真实的生物学差异，并对差异进行定量。 2. DIGE技术结合了蛋白质组学研究中经典的双向电泳技术和*的多重荧光分析技术。 3. 不同的样品分别由电荷和分子量匹配的DIGE荧光标记物预标记，随后再混合并在同一块胶上跑电泳。 4. 常规检测到小于10%的蛋白表达差异而统计学可信度达到95%。 二、实验流程： 1. 为保证实验顺利进行，须对样本进行预实验，以检测甲方提供的样品是否合格。 2. 预实验顺利完成后，进行正式实验，电泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三种荧光染料分别标记蛋白质样品（其中包括一个蛋白质内标），将标记好的蛋白质样品混合，在同一块胶上进行双向电泳，电泳结果分别用3种不同的激发波长得到不同颜色的荧光信号，根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。 3. 质谱分析（包括胶内酶切、串联质谱分析和数据库检索） 4、蛋白点的质谱鉴定：质谱的数据通过MASCOT数据库检索来确定蛋白点所对应的基因 三、主要应用： 采用DIGE技术，通过对不同类型，不同个体的细胞、组织、或经过不同处理和不同生长条件下蛋白质表达差异分析，在研究疾病的分子机理、分子诊断、药物作用机理、毒理学等方面都有广泛的应用。尤其是通过对各种疾病组织和正常组织进行比较，可以得到针对特定疾病（例如肿瘤）的一些标记蛋白质，得到的这些蛋白质可以用来作为疾病分子诊断的标记，或为进一步的疾病治疗以及药物开发提供有价值的信息。 DIGE是目前蛋白质组学研究中可信度和准确率zui高的技术之一，是已经经过验证并且被许多的蛋白质组学研究部门肯定的技术。DIGE技术已经在各种样品中得到应用，包括人、大鼠、小鼠、真菌、细菌等，主要用于蛋白质组学，如各种肿瘤研究，寻找疾病分子标志物，揭示药物作用的分子机制或毒理学研究等方面。ELISA试剂盒 |
