其他elisa试剂盒牛、猪组织中头孢噻呋残留检测方法 1、安全要求 实验操作时穿工作服、戴口罩和手套；提取和净化操作都应在通风橱中进行，避免溶剂气体吸人和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到容器中集中处理。 2、急救措施 皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗，有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。 3、适用范围 其他elisa试剂盒该标准操作规程适用于猪、牛的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中头孢噻呋残留量检测。 4、职责 进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验，质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。 5、检测原理 试料中残留的头孢噻呋，用二硫赤藓醇(DTE)溶液提取，使头孢噻呋及去呋喃甲酰头孢噻呋(DFC)有关代谢物从蛋白或含硫化合物中分离，产生DFC。DFC与碘乙酰胺反应，生成稳定的DFC乙酰胺衍生物(DCA)，原形药或代谢物均转化为DCA衍生物。用C18固相萃取柱对衍生物进行提取。强阴离子交换SAX)柱纯化，再用强阳离子交换(SCX)柱净化。DCA衍生物用液相色谱一紫外法测定，外标法定量。 6、方法灵敏度 本方法在牛肝脏组织中的定量限为500μg/kg，其他组织的定量限为100μg/kg。 7、注意事项 除特别说明外，淋洗和洗脱过程中应避免萃取柱柱床干涸。 8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求 除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的一级水。 8.1对照品、试剂和药物储备液、工作液准备 8.1.1头孢噻呋标准品以C19H17N5O7S3计，含量≥87.5％ 8.1.2二硫赤藓醇(DTE) 99％ 8.1.3磷酸85％ 8.1.4氯化 8.1.5氢氧化钾 8.1.6硼酸钾 8.1.7氯化钠 8.1.8碘乙酰胺97％ 8.1.9无水氯化钙 8.1.10磷酸二氢 8.1.11冰醋酸 8.1.12氢氧化钠 8.1.13三(TFA) 99％ 8.1.14乙腈色谱纯 8.1.15甲醇色谱纯 8.1.16 0.05M硼酸缓冲液(pH值约为9) 称取硼酸19g和KCl 3.7g，加水溶解并稀释至1000mL。 8.1.17 0.025M磷酸盐缓冲液(pH值7) 称取KH2PO43.4g，加水溶解并稀释至1000 mL。用45％KOH溶液调pH值至7。 8.1.18提取液(0.4％) 将lg DTE溶于250mL硼酸缓冲液中，每天制备。 8.1.19碘乙酰胺溶液(14％) 将7g碘乙酰胺溶于50mL磷酸盐缓冲液中，每天制备。 8.1.20 0.01M NaOH溶液 取NaOH饱和溶液0.52mL，加水稀释至1000mL。 8.1.21 0.1M氯化钠溶液 称取NaCl 5.9g，加水溶解并稀释至1000mL。 8.1.22 0.1M CaCl2溶液 称取CaCl2 11.1g，加水溶解并稀释至1000mL。 8.1.23 25％磷酸溶液 取磷酸25mL，加水稀释至100mL。 8.1.24 5％醋酸溶液 取醋酸5mL，加水稀释至100mL。 8.1.25 C18柱洗脱液 乙腈：水(15：85) 8.1.26 SAX柱预洗液 甲醇：0.1M NaCl溶液(25：75) 8.1.27 SAX柱洗脱液 乙腈：5％醋酸溶液(5：95) 8.1.28 SCX柱预洗液 甲醇：0.1M CaCl2溶液(25：75) 8.1.29 SCX柱洗脱液 乙腈：0.1M NaCl溶液(5：95) 8.1.30 氢氧化钾溶液(45％) 称取KOH 45g，加水溶解并稀释至100mL。 8.1.31 HPLC流动相 流动相A(0.1％TFA水溶液) 取lmL三氟乙，加水至1000mL。 流动相B(0.1％TFA乙腈溶液) 取1mL三氟乙，加乙腈至1000mL。 8.1.32头孢噻呋标准储备液(100μg／mL) 其他elisa试剂盒准确称量约11.2mg盐酸头孢噻呋标准品，于100mL量瓶中，用0.025M磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，配成浓度为100μg/mL的贮备液。将贮备液移至冷藏安全瓶中，在一20％贮藏，有效期6个月。 8.1.33头孢噻呋标准工作液(10.0μg /mL) 取5mL头孢噻呋标准储备液，于50mL量瓶中，用0.025M磷酸盐缓冲液稀释至刻度，即得。 8.1.34系列浓度标准工作溶液的制备 分别精密吸取100μg／mL头孢噻呋标准工作液0.06mL、0.5mL、1.0mL、3.0mL、6.0mL、10.0mL至10mL容量瓶中，用0.025M磷酸盐缓冲液稀释至刻度，配成0.06μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、6.0μg/mL、10.0μg /mL的系列工作液。 8.2仪器和设备 8.2.1 液相色谱仪(配紫外检测器) 8.2.2组织匀浆机 8.2.3分析天平感量0.000 01g 8.2.4天平 感量0.01g 8.2.5涡旋混合器 8.2.6恒温水浴振荡器 8.2.7高速离心机 8.2.8酸度计 8.2.9离心管 50mL 8.2.10 c1 8固相萃取柱l g/6mL Varian BondElut@ 8.2.11 SAX固相萃取柱500mg/10mL Varian BondElut@ 8.2.12 SCX固相萃取柱100mg/10mL Varian BondElut@ 8.2.13 微孔滤膜孔径0.45μm |
