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微纤丝相关糖蛋白抗体抗体分子标记技术
点击次数:482 更新时间:2023-06-19

微纤丝相关糖蛋白抗体抗体分子标记技术:


(一)原理


当应用化学氧化法时(NaI)遇强氧化剂,离子被氧化为分子,所生成的自由分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为残基,残基也可能进行化。在应用胺T( Chloramine T)法的实验中,所用的氧化剂(1,3,4,6- tetrachloro-3a,6adipheny l-glucoluril)强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后,先让其挥发(即让氧化剂将试管包被),然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中,反应完成即将混合液移入他管终止反应。


(二)准备


1.试剂


经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体;0.5mol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5;无载体的Na125I3.7GBq/ml(100mCi/ml)的NaOH液;100g/L三醋酸;70%乙醇;新鲜制备的含2mg/m1络胺T的0.5mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5);胺T反应终止缓冲液;


(三)操作要点


1.用胺T法进行化,也可在大约pH7.0的缓冲液中进行;


2.如果氧化反应损伤蛋白质,可将抗体与异硫酸荧光素(FITC)偶联)胺T量减少到0.02mg/m,并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml;


3. Iodogen-包被的试管可在干燥器中,于室温下保存多年;


4.1251标记的抗体,在制备后六周内均可使用(1251的半衰期为59.6天);


5.要注意保证所用的Na1251是新鲜的,陈旧制剂的比活性低;


6.碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰,因此降低其结合能力,但这种情况很少见。

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