牛白血病病毒（BLV）核酸检测试剂盒样品处理

1.参照相关标准采集样品，短期保存于 -20℃，长期保存请放置于 -80℃。1.样品的采集、处理和保存

采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。

样品采集后，放入密闭的塑料袋（一个采样点的样品放一个塑料袋），置保温箱中加冰、密封，24小时内送到实验室。

2.样品处理

液体样品可直接用于核酸提取；其他组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2g-5g 组织样品切成小块， 于研钵中充分研磨，加 5mL-15mL 生理盐水进行匀浆，制成悬液，5000r/min 离心 1min 取200μL 上清液进行提取。

3. 样品存放

采集或处理好的样品在2℃-8℃条件下保存应不超过24小时；若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免反复    冻融（冻融不超过3次）。

4. 核酸提取与质量控制 将处理后的样品悬液转移至1.5mL无菌离心管中，按照核酸提取试剂盒说明书进行操作。建议采用磁珠法或柱式法提取病毒RNA，提取过程中需严格避免外源性RNA酶污染。提取完成后，立即测定RNA浓度（OD260/280比值应在1.8-2.0之间），若纯度不足需重新纯化。提取的RNA应分装保存于-80℃，避免反复冻融。每批次提取需设置阴性对照（生理盐水）和阳性对照（已知BLV阳性组织悬液），以监控提取效率及交叉污染。

5. 反转录与PCR扩增 使用逆转录试剂盒将RNA合成cDNA，反应体系需包含随机引物和RNA酶抑制剂。反转录条件：42℃ 30min，85℃ 5min灭活逆转录酶。随后进行实时荧光定量PCR检测，引物探针设计需针对BLV保守区（如env或pol基因），反应程序为：95℃预变性3min；95℃ 15s、60℃ 30s，循环40次。每板需包含无模板对照（NTC）和阳性标准品（梯度稀释的BLV质粒），以排除假阳性和验证灵敏度。

6. 结果分析与注意事项 扩增曲线Ct值≤35且呈典型S型判为阳性；35<Ct值<40需重复检测；无扩增信号为阴性。若阴性对照出现扩增或阳性对照无信号，则该批次检测无效。实验结束后，所有接触样品的耗材需经121℃高压灭菌30分钟处理，操作台面用75%乙醇及紫外灯双重消毒。