1、 海水派琴虫感染PCR检测试剂盒简介 
货号：HB-905
为了适应贝类海水派琴虫（Perkinsus marinus）的快速检测和疫病监测的需要，本公司严格
依据 2014 年 OIE 水生动物疫病诊断手册中规定的相应 PCR 检测引物序列及其循环参数等技术标准，
在本公司严谨的产品质量保证体系管控下和质检。确保本试剂盒满足 OIE 中海水派琴虫的检测
标准要求。本试剂盒具有快速灵敏、特异、准确 、安全、操作简单、应用广泛等特点及优点。
2、 试剂盒组成 
试剂盒组成包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂，具体组成参见表 1：
表 1：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积 
核酸提取试剂： 样品 DNA 提取液 1
 样品 DNA 提取液 2
 5ml×1 管
500µl×1 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
海水派琴虫 PCR 反应液
Taq 酶(5U/ul)
阴性对照
海水派琴虫阳性对照
 5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
 1ml×1 管
 1ml×1 管
*保存条件：样品 DNA 提取液 1、2 和试剂盒须在-20℃保存。 
3、 样本采集，存放及运输 
3.1 样本采集
取新鲜贝类的消化腺上皮、腮、触须等组织25 mg置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干表
面水分后称重(根据需要)，置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水，进行手工匀浆研磨。注意整个
过程在冰上完成。
3.2 存放 
研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复
冻融（zui多冻融 3 次）。
3.3 运输 
采用泡沫箱加冰密封进行运输。 
4、 检测步骤 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在样本处理区进行)： 
4.1.1 取 n 个 1.5ml 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数和一管阴性对照之和，对每个管进行
编号标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分别加入待测样本和阴性对照各 100µl，一份样本换用
一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s,于 4℃～25℃条件下，12 000 r/min 离心 10 min。
4.1.3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混匀器上震荡混匀 5s,于 4℃～25℃
条件下，2 000 r/min 离心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，即为提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于-70℃冰箱内保存）。
4.2 PCR 检测 
4.2.1 海水派琴虫感染PCR检测试剂盒扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出 PCR 反应液、Taq 酶，2000×g 离心 5 秒钟。每个样品测试反应体系配制见下表
2。
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 PCR 反应液 Taq 酶 合计
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加样（样本处理区进行）：
向每个PCR管中各分装15μL的混合液，再分别加入样本DNA模板10μL，盖紧管盖，500 r/min
离心 30 s。
4.2.3 PCR 检测（在检测区进行）：
循环条件设置：
*阶段，95 o
C /4 min；
第二阶段，94 o
C/1 min，57 o
C/1 min；65 o
C/3 min; 40个循环；
第三阶段，65 o
C/10 min;
第四阶段，4 o
C 保存
4.3 琼脂糖电泳
用电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶
面。将PCR扩增产物和相应电泳上样缓冲液（Loading Buffer）按比例混匀后加入样品孔。在电泳时
设立DNA标准分子量作对照。5 V/cm电泳约0.5 h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下或凝胶成
像仪的紫外透射光下观察是否扩增初预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录。
5、 结果判定 
5.1 海水派琴虫的PCR后阳性对照会出现一条509 bp的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。
5.2 待测样品 PCR 扩增后能在相应 509 bp DNA 位置上有带，可判为海水派琴虫阳性。
6、 相关技术信息 
6.1 海水派琴虫感染PCR检测试剂盒引物序列
F：5’-CTT-TTG-YTW-GAG-WGT-TGC-GAG-ATG-3’
R：5’-CGA-GTT-TGC-GAG-TAC-CTC-KAG-AG-3’