人视网膜神经胶质瘤细胞（通常指 WERI-Rb-1 细胞系）是一种广泛用于视网膜母细胞瘤研究的体外模型，其培养过程需严格遵循无菌操作与标准化流程，以确保细胞活性、纯度及实验结果的可重复性。以下是基于科研实践与供应商信息整合的标准化培养方案。

一、培养基配制与培养条件

‌基础培养基‌：RPMI-1640

‌添加成分‌：

胎牛血清（FBS）：10%

培养基保存‌：4℃避光保存，建议配制量不超过200 mL，避免反复冻融或长期存放导致污染或成分降解

‌培养环境‌：

温度：37℃

CO₂浓度：5%

湿度：70%–80%，防止培养液蒸发

✅ ‌提示‌：尚恩生物推荐使用其专用培养基（货号 SNLM-470），可提升细胞贴壁与生长稳定性。

二、细胞复苏操作步骤

将冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴中快速摇晃解冻（≤2分钟）

无菌操作转移至超净台，用75%酒精擦拭管壁表面消毒

将细胞悬液转移至含5 mL预热培养基的离心管中，轻轻混匀

1000 rpm离心5分钟，弃上清，加入6 mL新鲜培养基重悬细胞

接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO₂培养箱静置过夜

次日观察细胞贴壁与生长状态，确认无污染后进行换液或传代

⚠️ ‌注意‌：若收到为2 mL冻存管形式，应直接接种至T25瓶或6 cm培养皿，加5 mL培养基培养过夜。

三、传代培养操作流程

当细胞密度达到80%汇合度或悬浮细胞数量超过1×10⁶ cells/mL时，需进行传代：

‌收集细胞‌：

悬浮细胞：直接将培养瓶中液体转移至离心管

贴壁细胞：弃去旧培养液，PBS轻洗一次，加入0.25%消化1–2分钟，显微镜下观察细胞变圆后，加入培养基终止消化

‌离心处理‌：1000 rpm离心5分钟，弃上清

‌重悬分瓶‌：用新鲜培养基重悬细胞沉淀，按1:2比例分装至两个新培养瓶

‌补液培养‌：每瓶补充6–8 mL培养基，放入培养箱继续培养

✅ ‌建议‌：传代初期可保留部分原培养基用于过渡培养，减少细胞应激反应。

四、冻存操作规范

为保障细胞长期稳定保存，建议早期冻存主细胞库：

‌冻存液配方‌：

推荐一：90% FBS + 10% DMSO（现配现用）

推荐二：92% 培养基 + 8% DMSO（适用于经验丰富的操作者）

可选无血清冻存液（如ChemicalBook提供的货号C7001）

‌操作步骤‌：

离心收集细胞，用冻存液重悬至终浓度2–3×10⁶ cells/mL

分装至冻存管（1 mL/管），做好标记

使用程序降温盒以-1℃/min速率降温至-80℃，次日转入液氮长期保存

无程序盒时：4℃静置10分钟 → -20℃ 2小时 → -80℃过夜 → 液氮

✅ ‌提示‌：冻存后应及时复苏一管检测细胞活性，作为冻存质量评估依据。