掌握鸵鸟源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒的标准化正确使用全流程，覆盖从前期准备、标准曲线制备、样本DNA提取、qPCR反应设置、结果判读到后续收尾的全环节规范操作，保障实验结果准确可靠。

一、实验前准备

‌耗材与环境准备‌：提前准备带芯无酶吸头、无菌离心管，划分试剂配制、样本处理、PCR扩增三个独立操作区，实验前对各区域紫外消毒30分钟。

‌试剂预处理‌：试剂盒内所有组分自然融化，充分混匀后短暂离心，反应液全程避光放置，避免反复冻融超过7次。

二、标准曲线梯度稀释

标记6个离心管，每管加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。

从1×10⁸拷贝/μL的阳性对照开始，依次10倍梯度稀释，震荡1分钟后冰上暂存，得到6个梯度的标准曲线样品。

三、样本DNA制备

用兼容的核酸纯化方法提取待测样本DNA，若有N个待测样本，同步设置N+2个提取体系，分别为待测样本、1个样本制备阳性对照、1个样本制备阴性对照。

提取完成后检测DNA纯度，OD260/280控制在1.8左右，避免降解。

四、qPCR反应体系设置

定量分析时标记N+9个PCR管，定性分析仅需选1个标准曲线梯度即可。

按20μL体系依次加入反应组分，先加待测样本与阴性对照，最后加阳性对照模板，短暂离心排除管内气泡，盖紧管盖。

五、扩增与结果判读

按仪器适配的参数设置扩增程序，完成荧光信号采集。

定量检测以阳性对照浓度log值为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，推算待测样本浓度；定性检测时，阴性对照Ct≥40、阳性对照Ct≤30为有效实验，待测样本Ct≥40为阴性，≤35为阳性，35-40区间需重复验证。

六、实验收尾

用10%次氯酸或75%酒精擦拭工作台与移液器，所有实验耗材按生物危害废物规范处理。

再次对操作区进行紫外消毒，避免残留核酸污染后续实验。