PrimaCell™大鼠血管内皮细胞试剂盒培养

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PrimaCell™大鼠血管内皮细胞试剂盒

总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。生物科技提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。
cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA第一链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。
蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人关节软骨组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

细胞培养方法；

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

实验事项；

1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，前一个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。
5.  试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
    建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
    如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请后乘以稀释倍数。

层连蛋白/板层素(LN)ELISA检测试剂盒MonkeyLaminin,LNELISAKit 96T/48T  20261-38-5银杏酸（C13：0）  Ginkgolic Acid (C13:0)

犬球蛋白E(IgE)试剂盒 Canine Immunoglobulin E,IgE ELISA Kit  35825-57-1隐丹参酮说明书  Cryptotanshinone

英文名称HumanPlatelet-DerivedGrowthFactorSolubleReceptor，PDGFsRαELISAkit人血小板源性生长因子可溶性受体α(PDGFsRα)规格：96T/48T  905-99-7隐绿原酸品牌  Cryptochlorogenic acid

化微粒体1脂酶D2(PhospholipaseD2)活性比色法定量检测试剂盒20  印乌碱规格  Indiaconitine

Ratinducibleniicoxidesyhase,iNOSELISA试剂盒大鼠诱导型合成酶(iNOS)ELISA试剂盒规格：96T/48T  552-59-0樱黄素  Prunetin
260413-62-5女贞苷说明书  ligustroflavone   英文名称RatTATELISAKit大鼠凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)规格：96T/48T

260413-62-5女贞苷说明书  Ligustroflavone   英文名称Rattarate-resistaacidphosphataseorm5bELISAKit大鼠抗酸酸性1酸酶5b(ACP5b)规格：96T/48T

2586-96-1莲心碱规格  Liensinine  英文名称Rattarate-resistaacidphosphataseorm5bELISAKit大鼠抗酸酸性1酸酶5b(ACP5b)规格：96T/48T

256925-92-5升麻酮醇-3-O-α-L-拉伯糖苷说明书  Cimigenol-3-O-α-L-arabinoside   英文名称RatT4ELISAKit大鼠甲状腺素(T4)规格：96T/48T

25459-91-0去亚甲基小檗碱说明书  Demethyleneberberine   英文名称RatT4ELISAKit大鼠甲状腺素(T4)规格：96T/48T
小鼠整合素α-IIb(Itga2b/CD41)ELISA试剂盒 ，英文名： Itga2b/CD41 ELISA Kit  24697-74-3盐酸益母草碱说明书  Leonurine

小鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)ELISA检测试剂盒Mouseglialfibrillaryacidicprotein,GFAPELISAKit 96T/48T  65-19-0盐酸育亨宾品牌   Yohimbine

人巨噬细胞来源的趋化因子(MDC/CCL22)试剂盒 Human MDC ELISA kit  17912-87-7杨梅苷规格   Myricetrin

Ratalpha-granularmembraneprotein,GMP-140ELISAKit大鼠血浆α颗粒膜蛋白(GMP-140)ELISA试剂盒规格：96T/48T  529-44-2杨梅素  Myricetin

载玻片细胞β脘蛋白(PRION)蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20  1362-42-1洋艾素说明书  Absinthiin
PrimaCell™大鼠血管内皮细胞试剂盒培养5986-55-0百秋李醇说明书  Patchouli alcohol    猪粘膜血管地址素细胞黏附分子1(MADCAM1)试剂盒 Pig mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1,MADCAM1 ELISA kit

5957--80-2鼠尾草酚品牌  Carnosol  猪粘蛋白/粘液素5B(MUC5B)试剂盒 Pig mucin-5 subtype B,MUC5B ELISA Kit

5945-50-6水晶兰苷说明书  Monotropein  猪粘蛋白/粘液素5AC(MUC5AC)试剂盒 Pig mucin-5 subtype AC,MUC5AC ELISA Kit

5945-50-6水晶兰苷品牌  Monotropein  猪粘蛋白/粘液素2(MUC2)试剂盒 Pig Mucin-2,MUC2 ELISA Kit

5940-00-1豯莶精醇规格  Darutigenol  猪粘蛋白/粘液素1(MUC1)试剂盒 Pig Mucin-1,MUC1 ELISA Kit

注意事项；

1. 接收到，肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
2.用75%的酒精消毒（建议配置75%的酒精的水是灭菌过的）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管*吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
5.用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
6.1000rpm，5min离心，重悬细胞。
7.换新的细胞培养瓶，37℃，5%CO2培养。