HRP催化过氧化物的氧化反应，代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在Elisa中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）和 ABTS[2,2’-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有zui高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物zui常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2 一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在Elisa中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，zui适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些ELISA试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-（4-羟基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于Elisa的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物（urea peroxide）。H2O2应用zui多，但尿素过氧化物为固体，作为ELISA试剂盒较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。 |
