猴IL1A ELISA假阳性绝大多数由样本内源性干扰物质引发,以下几类样本是假阳性高发群体,实验前需重点筛查。 严重溶血的猴血清/血浆样本 诱因:红细胞破裂后大量血红蛋白释放,其自带类HRP过氧化物酶活性,不需要结合抗体就能直接催化TMB底物显色。 表现:全板本底整体偏高,阴性对照孔OD值也会明显大于0.1,几乎所有孔的信号都出现虚高。 防控:采集猴血液后30分钟内低温离心,直接弃去肉眼可见红色浑浊的溶血样本。 异嗜性抗体/类风湿因子阳性猴血清 诱因:猴体内天然存在的异嗜性抗体,可直接桥接固相捕获抗体和HRP标记检测抗体,不需要猴IL1A抗原参与就能形成完整三明治复合物。 表现:个别猴样本测出异常高值,梯度稀释后信号不成比例下降,和其他同批次样本无规律关联。 防控:检测前加入商品化异嗜性抗体阻断剂,或用10%正常猴非免疫血清预孵育15分钟封闭干扰位点。 脂血、浑浊或被微生物污染的样本 诱因:高浓度脂质、纤维蛋白絮状物、细菌代谢产物会大量附着在板孔内壁,洗板无法清除,直接引发非特异性吸附。 表现:样本孔底部有肉眼可见的浑浊沉淀,显色后背景发灰,OD值明显偏离标准曲线梯度。 防控:样本采集后充分离心取澄清上清,直接剔除肉眼可见浑浊、长菌的样本。 免疫缺陷/病毒感染猴的血清样本 诱因:感染SRV、SIV等猴免疫缺陷病毒的猴只,体内免疫球蛋白谱严重紊乱,大量异常IgG会非特异性结合ELISA体系中的抗体。 表现:这类猴群的ELISA初筛假阳性率可高达80%以上,几乎所有炎症因子指标都容易测出虚高信号。 防控:这类猴的ELISA阳性结果必须用Western Blot等正交方法确证,不能直接作为最终判定依据。 反复冻融次数过多的样本 诱因:猴IL1A是活性炎症蛋白,反复冻融超过2次会导致蛋白变性,暴露大量非特异性结合位点,同时释放细胞内蛋白酶和杂蛋白。 表现:样本OD值忽高忽低,平行复孔CV值远大于20%,结果重复性极差。 防控:所有猴血清样本分装成单次实验用量,-80℃冻存,避免反复冻融。
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