ChIP技术的应用
染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的,可采用狭缝杂交(Slot blot)的方法,把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交,来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。还可以根据靶序列设计引物,用半定量PCR的方法进行测定,或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput),可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少,所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针,再进行整个基因组扫描。还可以把沉淀的DNA克隆到载体中,进行测序,寻找该序列附近的开放阅读框,发现新的基因调节序列。
目前,随着人类基因组测序工作的基本完成,研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大,上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片(chip)技术与染色质免疫沉淀技术(ChIP)相结合,为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DN***段,和另一个被标记不同探针的对照组样品一起,与DNA芯片杂交,再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析,具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络,染色质修饰机制在基因组中的调控,DNA的复制,修复以及修饰,基因的转录与核运输等诸多方面。
染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列,即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在*次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。
随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注,运用该技术发表的文章也逐渐增多,大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore推出的Magna ChIP试剂盒,利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物,提高了ChIP的效率,简化了操作的过程,缩短了实验的时间,还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能,是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。
近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用,其原理与DNA类似,也包括甲醛固定,超声波破细胞,免疫沉淀,交联逆转,RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是,交联逆转只用Proteinase K,要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理,分析时用RT-PCR,芯片杂交要用cDNA芯片等。
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