PrimaCell™人脐动脉平滑肌细胞试剂盒说明

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PrimaCell™人脐动脉平滑肌细胞试剂盒

总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。生物科技提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。
cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA第一链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。
蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人关节软骨组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

细胞培养方法；

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

实验事项；

1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，前一个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。
5.  试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
    建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
    如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请后乘以稀释倍数。

RatFolicacid,FAELISA试剂盒大鼠叶酸(FA)ELISA试剂盒规格：96T/48T  33570-04-6白果内酯  Bilobalide

小鼠组织蛋白酶D(CTSD)ELISA试剂盒 ，英文名： CTSD ELISA Kit  28095-18-3白花前胡醇说明书  Peucedanol

绵羊白介素2(IL-2)ELISA检测试剂盒SheepIerleukin2,IL-2ELISAKit 96T/48T  81740-07-0白花前胡乙素品牌  Praeruptorin B

犬胰岛素受体β(ISR-β)试剂盒 Canine Insulin Receptor β,ISR-β ELISA KIT  83382-71-2白花前胡丙素规格  Praeruptorin C

英文名称Mouse8-iso-ProstaglandinF2aELISAKIT小鼠8-异前列腺素F2α(8-ISOPGF2a)规格：96T/48T  白花前胡丁素  Praeruptorin D
89412-79-3竹节香附素A说明书  Raddeanin A  组织丁酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒20

88915-64-4罗汉果苷IV规格  Mogroside IVe   组织低密度脂蛋白胆(LDL-Cholesterol)酶连续循环比色法定量检测试剂盒20

88901-45-5罗汉果皂苷ⅡA2  mogroside ⅡA2   组织单胺氧化酶B型(MAO-B)活性化学发光法定量检测试剂盒20

88901-42-2罗汉果皂苷ⅢA1说明书  mogroside ⅢA1   组织沉默调节蛋白1(SI1)活性荧光定量检测试剂盒20

88901-41-1罗汉果皂苷IVa  mogroside IVa   组织超长链脂酰辅酶A脱氢酶(ACYLCOADEHYDROGENASE)活性比色法定量检测试剂盒20
RatannexinⅤ,ANX-ⅤELISAKit大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒规格：96T/48T  470-37-1华蟾毒精  Cinobufagin

组蛋白H2A-K9乙酰化检测试剂盒10/20等  557-61-9二十八烷醇说明书  Octacosanol

Mousealpha-granularmembraneprotein,GMP-140ELISA试剂盒小鼠血浆α颗粒膜蛋白(GMP-140)ELISA试剂盒规格：96T/48T  14937-32-71,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖品牌  1,2,3,4,6-pentagalloylglucose

小鼠孕酮(PROG)ELISA试剂盒 ，英文名： PROG ELISA Kit  478-61-5小檗胺规格  Berbamine

小鼠高灵敏度促甲状腺激素(U-TSH)ELISA检测试剂盒Mouseulasensitivethyroid-stimulatinghormone,U-TSHELISAKit 96T/48T  7437-54-9甲基辛弗林盐酸盐  4-hydroxyephedrine
PrimaCell™人脐动脉平滑肌细胞试剂盒说明书13476-25-0乌药内酯规格  Linderane  英文名称RatGamma-aminobyricacidELISAKit大鼠γ氨基(GABA)规格：96T/48T

13463-28-0圣草苷  Eriocitrin  英文名称RatGADELISAKit大鼠谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD)规格：96T/48T

134418-28-3脱水穿心莲内酯规格  dehydroandrographolide  英文名称RatGADELISAKit大鼠谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD)规格：96T/48T

134-01-0氯化芍药素品牌  Peonidin chloride   英文名称Ratf-β-HCGELISAKIT大鼠游离β绒毛膜促性腺激素(f-β-HCG)规格：96T/48T

13395-02-3马兜铃内酰胺规格  Aristololactam  英文名称RatFXELISAKit大鼠凝血因子X(FX)规格：96T/48T

注意事项；

1. 接收到，肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
2.用75%的酒精消毒（建议配置75%的酒精的水是灭菌过的）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管*吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
5.用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
6.1000rpm，5min离心，重悬细胞。
7.换新的细胞培养瓶，37℃，5%CO2培养。