小鼠肺大静脉平滑肌细胞提取物培养

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小鼠肺大静脉平滑肌细胞提取物【Mouse Lung: Normal Vein Smooth Muscle Cell Derivatives】

小鼠肺大静脉平滑肌细胞提取物是从小鼠肺大静脉平滑肌细胞提取的，小鼠肺大静脉平滑肌细胞从正常小鼠肺大静脉组织制备。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。

总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。生物科技提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。
cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA第一链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。
蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人关节软骨组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

实验事项：

1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，前一个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。
5.  试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
    建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
    如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请后乘以稀释倍数。

培养皿Bis(3-ethyl-methyl-maleimidophenyl)methane53913双(3-乙基-甲基-马来基苯基)甲烷

培养皿架 有机玻璃Bisphenol P21671双酚P

平头镊子Bis(2-carboxyethyl)isocyanurate2双(2-羧乙基)异脲酸酯

枪状镊子4,4'-Bis(α,α-dimethylbenzyl)diphenylamine08174,4'-双(α,α-二甲基苄基)

三福记号笔 黑色单头 0012,5-Bis(4-aminophenyl),3,4-oxadiazole242552,5-二(4-基),3,4-恶二唑
Mannitol  69-65-8  中文名：甘露醇  分子式：C6H14O6  度：98.5%  关键词：  利尿剂; 脱水剂; 中药对照品; 中药标准品; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠褪黑素(MT)ELISAKit  

Mannioside A  1038922-95-0  中文名：  分子式：C39H62O13  度：%  关键词：  螺甾烷; 甾苷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠载脂蛋白H(Apo-H)ELISAKit  

m-Anisic acid  586-38-9  中文名：间茴香酸  分子式：C8H8O3  度：98.0%  关键词：    小鼠热休克因子1(HSF1)ELISAKit  

Manidipine dihydrochloride  89226-75-5  中文名：盐酸马尼地平  分子式：C35H40Cl2N4O6  度：98.0%  关键词：    小鼠血小板因子3(PF-3)ELISAKit              

Malic acid 4-Me ester  66178-02-7  中文名：  分子式：C5H8O5  度：%  关键词：  中药对照品; 中药标准品; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠褪黑素   英文名称：   Mouse Melatonin   规格：   48T/96T   英文缩写：   MLT
盐酸苯海拉明-d6  Diphenhydramine-d6 Hydrochloride  质量规格：美国进口 真菌/酵母细胞细胞壁分离试剂盒20

普仑司特半水合物  Pranlukast hemihydrate  质量规格：美国进口 真菌/酵母细胞线粒体DNA萃取试剂盒10/20

(R)-美托洛尔  (R)-Metoprolol  质量规格：美国进口 真菌/酵母细胞线粒体分离(粗提)试剂盒10

α-羟基美托洛尔(非对映)  α-Hydroxy Metoprolol(Mixture of Diastereomers)  质量规格：美国进口 真菌/酵母细胞线粒体分离(活性)试剂盒10

(S)-美托洛尔  (S)-Metoprolol  质量规格：美国进口 真菌/酵母细胞总RNA分离试剂盒20

O-去甲基美托洛尔  O-Desmethyl Metoprolol  质量规格：美国进口 真菌/酵母纤维素酶(cellulase)活性比色法定量检测试剂盒20

草酸脱氢氨氯地平  Dehydro Amlodipine Oxalate  质量规格：美国进口 真菌/酵母腺苷酸激酶(Adenylatekinase)活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒20

(R)-氨氯地平  (R)-Amlodipine  质量规格：美国进口 真菌/酵母总巯基含量比色法定量检测试剂盒20

阿瑞匹坦-标记d4  Aprepitant - Labeled d4  质量规格：美国进口 真菌NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒20(10样本)

阿瑞匹坦-M3代谢物  Aprepitant-M3 Metabolite  质量规格：美国进口 真菌格兰-韦革氏(Gram-Weige)染色试剂盒50
小鼠肺大静脉平滑肌细胞提取物培养大鼠降钙素   英文名称：   calcitonin   规格：   48T/96T   英文缩写：   CAL  Procaine hydrochloride  中文名：盐酸普鲁卡因  分子式：C13H21ClN2O2 

大鼠激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISAKit     Toltrazuril  69004-03-1  中文名：托曲珠利  分子式：C18H14F3N3O4S  度：98.0%   

大鼠活化素A受体抗体(ACV-RAb)ELISAKit     Periplocoside M  中文名：北五加皮苷M  分子式：C34H52O9 

大鼠环0酸腺苷   英文名称：   cyclic adenosine monophosphate   规格：   48T/96T   英文缩写：   CAMP  Procaine hydrochloride  1951/5/8  中文名：盐酸普鲁卡因  分子式：C13H21ClN2O2  度：98.0%  关键词： 

大鼠环0酸鸟苷   英文名称：   Cyclic guanosine monophosphate   规格：   48T/96T   英文缩写：   cGMP  Procaine hydrochloride  1951/5/8  中文名：盐酸普鲁卡因  分子式：C13H21ClN2O2

注意事项：

1. 接收到，肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
2.用75%的酒精消毒（建议配置75%的酒精的水是灭菌过的）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管*吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
5.用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
6.1000rpm，5min离心，重悬细胞。
7.换新的细胞培养瓶，37℃，5%CO2培养。